Introducción a `clusterProfiler`

Enriquecimientos

Un análisis de enriquecimiento funcional suele aplicarse para extraer información biológica relevante, ya sea de una lista filtrada de genes relevantes o bien de todo el genoma evaluado por un valor estadístico. El ejemplo más conocido de esta lista podría ser la lista filtrada de genes diferencialmente expresados (por algún punto de corte de logFold Change) o bien la lista de todos los genes estimado por su valor de logFold Change.

Si bien hay varios métodos para hacer enriquecimiento¹, los dós métodos más comunes son el Análisis de sobrerepresentación (Over-representation analysis o ORA) y el Análisis de Enriquecimiento de Conjuntos de Genes (Gene Set Enrichment Analysis o GSEA). Ambos incluidos en clusterProfiler.

Análisis	Lo que require de entrada	Como luce la salida	✅ Pros	⚠️ Cons
ORA (Over-representation Analysis)	Una lista de genes (no se requeiren estadísticos)	Una prueba hipergeométrica por vía	- Sencillo - Barato computacionalmente para calcular p-values	- Ignora estadísticas asociadas con los genes y requiere puntos de corte arbitrarios - Asume independencia de genes y pathways
GSEA (Gene Set Enrichment Analysis)	Una lista de IDs de genes con un valor estadístico por gen	Un puntaje de enriquecimiento (enrichment score ES) por vía	- Incluye todos los genes (Sin puntos de corte arbitrarios)	- Las permutaciones pueden ser computacionalmente costosas - No considera sobrelape de vías

Over-representation analysis

Gene Set Enrichment Analysis

Video sobre GSEA

Enrichr

Herramienta en linea para hacer ORA https://maayanlab.cloud/Enrichr/

Entonces ¿Para qué queremos clusterProfiler?

Over-representation analysis

GO Over-representation analysis con `clusterProfiler`

Instalar y cargar paquetes

#BiocManager::install("clusterProfiler")
library(clusterProfiler)
library(tidyverse)

Anotación

Vamos a usar los genes diferencialmente expresados del trabajo The regulatory landscape of retinoblastoma: a pathway analysis perspective, por lo que usaremos la anotación de humano "org.Hs.eg.db". Puedes ver las anotaciones disponibles aquí.

#BiocManager::install("org.Hs.eg.db", character.only = TRUE)
library("org.Hs.eg.db", character.only = TRUE)

Preparar entrada

# Lectura de la tabla de genes diferencialemente expresados
degs = readRDS("data/degs.RDS")

# necesitamos el log2 fold change 
original_gene_list <- degs$logFC

# Nombramos el vector
names(original_gene_list) <- degs$ESGN

# eliminamos cualquier NA 
gene_list<-na.omit(original_gene_list)

# odernamos la lista en orden decreciente (requerido por clusterProfiler)
gene_list = sort(gene_list, decreasing = TRUE)

# extraemos los genes significativos (p ajustada < 0.05)
sig_genes_df = subset(degs, adj.P.Val < 0.05)

# para los resultados significativos, queremos filtrar por log2fold change
genes <- sig_genes_df$logFC

# nombramos el vector
names(genes) <- sig_genes_df$ESGN

# omitimos posibles NAs
genes <- na.omit(genes)

# filtramos por mínimo log2fold change (log2FoldChange > 2)
genes <- names(genes)[abs(genes) > 2]

Crear objeto enrichGO

Parámetros:

ont Ontología de GO a utilizar. Opciones: "BP", "MF" o "CC"
keyType Esta puede variar depepndiendo de la anotación (gene ids). Por ejemplo para "org.Hs.eg.db", las opciones son:

"ACCNUM" "ALIAS" "ENSEMBL" "ENSEMBLPROT" "ENSEMBLTRANS" "ENTREZID" "ENZYME" "EVIDENCE" "EVIDENCEALL" "GENENAME" "GENETYPE" "GO" "GOALL" "IPI" "MAP" "OMIM" "ONTOLOGY" "ONTOLOGYALL" "PATH" "PFAM" "PMID" "PROSITE" "REFSEQ" "SYMBOL" "UCSCKG" "UNIPROT"

Puedes checar las opciones de la anotación de tu organismo usando la función keytypes, por ejemplo keytypes(org.Hs.eg.db).

Creación del objeto `enrichResult`

go_enrich <- enrichGO(gene = genes,
                      universe = names(gene_list),
                      OrgDb = org.Hs.eg.db, 
                      keyType = 'ENSEMBL',
                      readable = TRUE,
                      ont = "BP",
                      pvalueCutoff = 0.05, 
                      qvalueCutoff = 0.10)

Output

Table of results

head(go_enrich)

Upset Plot

Enfatiza el sobrelape de genes a lo largo de los diferentes set de genes.

#BiocManager::install("enrichplot")
library(enrichplot)
upsetplot(go_enrich)

Barplot

barplot(go_enrich, 
        drop = TRUE, 
        showCategory = 10, 
        title = "GO Biological Pathways",
        font.size = 8)

Dotplot

dotplot(go_enrich)

KEGG Over-representation analysis

Si queremos enriquecer patways de KEGG necesitamos convertir los ids para poder usar la función gseKEGG(). Para ello podemos usar la función bitr que está incluida el clusterProfiler. Es normal que algunos mensajes y warnings salgan al usar esta función.

En la función bitr, el parámetro fromType debe ser el tipo de keyType del de la función gseGO que vimos anteriormente (la fuente original). Este parámetro es usado dos veces más la crear los dedup_ids y el degs2.

El otro parámetro toType en la función bitr también debe ser otra de las anitaciones disponibles el keyTypes("org.Hs.eg.db") y debe mapear a alguna de 'kegg', 'ncbi-geneid', 'ncbi-proteinid' o 'uniprot' porque la función gseKEGG() solo acepta alguna de estas 4 opciones como entrara en el parámetro keytype. En el caso de org.Hs.eg.db usaremos 'ENTREZID' para toType, ya que este se corresponde con el ncbi-geneid y tiene mejor match con 'ENSEMBL', pero podríamos también usar 'UNIPROT'.

Como nuestra entrada inicial usaremos nuestra original_gene_list que creamos para el enriquecimiento en GO.

Prepare Data

# Convertimos los gene IDs para la función enrichKEGG
# Podría ser que perdamos algunos genes aquí dado que algunas conversiones no son compatibles
ids<-bitr(names(original_gene_list), fromType = "ENSEMBL", toType = "ENTREZID", OrgDb="org.Hs.eg.db")

# Removemos IDS duplicados (aquí se usa "ENSEMBL", pero debería de ser lo que hayamos usado como keyType)
dedup_ids = ids[!duplicated(ids[c("ENSEMBL")]),]

# Creamos un nuevo dataframe df2 el cual solo tiene genes que se an convertido exitosamente usando la función bitr

degs2 = degs[degs$ESGN %in% dedup_ids$ENSEMBL,]

# Creamos una nueva columna en degs2 con los ENTREZ ids correspondientes
degs2$Y = dedup_ids$ENTREZID

# Creamos un vector de genes del universo
kegg_gene_list <- degs2$logFC

# Nombramos el vector con los ENTREZ ids
names(kegg_gene_list) <- degs2$Y

# Verificamos que no haya NAs 
kegg_gene_list<-na.omit(kegg_gene_list)

# Ordenamos la lista en orden decreciente (requerido por for clusterProfiler)
kegg_gene_list = sort(kegg_gene_list, decreasing = TRUE)

# Extraemos los resultados significativos del degs2
kegg_sig_genes_degs = subset(degs2, adj.P.Val < 0.05)

# También filtraremos por log2fold change
kegg_genes <- kegg_sig_genes_degs$logFC

# Nombramos el vector con los IDs convertidos
names(kegg_genes) <- kegg_sig_genes_degs$Y

# eliminanmos NAs
kegg_genes <- na.omit(kegg_genes)

# Y ahora si filtramos por log2fold change
kegg_genes <- names(kegg_genes)[abs(kegg_genes) > 2]

Creamos el objeto `enrichKEGG`

Parámetros:

organism código KEGG del organismo: La lista completa está aquí: https://www.genome.jp/kegg/catalog/org_list.html (se necesita el código de 3 letras). En el caso del humano es "hsa"
keyType one of 'kegg', 'ncbi-geneid', 'ncib-proteinid' or 'uniprot'.

kk <- enrichKEGG(gene=kegg_genes, 
                universe=names(kegg_gene_list),
                organism="hsa",
                pvalueCutoff = 0.05, 
                keyType = "ncbi-geneid")
head(kk)

Barplot

barplot(kk, 
        showCategory = 10, 
        title = "Enriched Pathways",
        font.size = 8)

Dotplot

dotplot(kk, 
        showCategory = 10, 
        title = "Enriched Pathways",
        font.size = 8)

Pathview

Con este paquete se puede visualizar nuestros genes en las vías de KEGG generando una imagen PNG y un PDF diferente.

Parámetros:

gene.data Esta es la lista gene_list creada arriba, el tipo de ids tiene que coincidir con el de gene.idtype pathway.id Tenemos que elegir aquí nosotros alguna. Como la idea es visualizar nuestras vías significativamente enriquecidas, pordemos usar los ids de los pathways que nos sale en head(kk).
species El id de organism de la función enrichKEGG, en este caso "hsa" gene.idtype el tipo de ids utilizados en gene.data pero sacado del objeto gene.idtype.list. En este caso tomamos el tercer elemento de esta lista.

#BiocManager::install("pathview")
library(pathview)

# Produce una gráfica de KEGG (PNG)
hsa <- pathview(gene.data=gene_list, pathway.id="hsa04740", species = "hsa", gene.idtype=gene.idtype.list[3])

# Produce una gráfica diferente (PDF)
hsa <- pathview(gene.data=gene_list, pathway.id="hsa04740", species = "hsa", gene.idtype=gene.idtype.list[3], kegg.native = FALSE)

Las imágenes se salvan en su directorio de trabajo.

Gene Set Enrichment Analysis

GO Gene Set Enrichment Analysis con `clusterProfiler`

Instalación y cargado de paquetes

#BiocManager::install("clusterProfiler")
#BiocManager::install("pathview")
#BiocManager::install("enrichplot")
library(clusterProfiler)
library(enrichplot)
library(ggplot2)

Anotación

Vamos a usar, de nuevo, los genes diferencialmente expresados del este lindo trabajo The regulatory landscape of retinoblastoma: a pathway analysis perspective. Por lo que usaremos la anotación de humano "org.Hs.eg.db" de nuevo. Recuerden que la lista completa está aquí.

#BiocManager::install("org.Hs.eg.db", character.only = TRUE)
library("org.Hs.eg.db", character.only = TRUE)

Prepare Input

# Lectura de la tabla de genes diferencialemente expresados

degs = readRDS("data/degs.RDS")

# necesitamos el log2 fold change 
original_gene_list <- degs$logFC

# Nombramos el vector
names(original_gene_list) <- degs$ESGN

# eliminamos cualquier NA 
gene_list<-na.omit(original_gene_list)

# odernamos la lista en orden decreciente (requerido por clusterProfiler)
gene_list = sort(gene_list, decreasing = TRUE)

Gene Set Enrichment

Parámetros:

keyType Igual que en el ORA, el tipo de ids utilizados en nuestra lista. Receurden que los tipos permitidos se enlistan con el comado keytypes("org.Hs.eg.db"). Recueden que si usan algo distinto a Humano deben cambiar su anotación.
ont Ontología. Alguno de "BP" (procesos biológicos), "MF" (función molecular), "CC" (componente celular) o "ALL" (todas)
minGSSize tamaño mínimo de geneSet para analizar.
maxGSSize tamaño máximo de genes anotados para probar. pvalueCutoff punto de corte del p-value.
pAdjustMethod metodo para ajustar la p, puede ser uno de estos: "holm", "hochberg", "hommel", "bonferroni", "BH", "BY", "fdr", "none"

gse <- gseGO(geneList=gene_list, 
             ont ="ALL", 
             keyType = "ENSEMBL", 
             minGSSize = 3, 
             maxGSSize = 800, 
             pvalueCutoff = 0.05, 
             verbose = TRUE, 
             OrgDb = "org.Hs.eg.db", 
             pAdjustMethod = "BH")

Noten que hemos dado toda la lista de genes con su valor de lofFC. Estás enriqueciendo sin un criterio arbitrario (elegido por nosotros), puro dato duro y maduro.

Outputs

Tabla de resultados

head(gse)

Dotplot

#BiocManager::install("DOSE")
require(DOSE)
dotplot(gse, showCategory=10, split=".sign") + facet_grid(.~.sign)

Ridgeplot

Agrupados por pathways, se generan gráficos de densidad utilizando la frecuencia del logFold Change por gen dentro de cada set. Útil para interpretar vías reguladas al alza o a la baja.

ridgeplot(gse) + labs(x = "enrichment distribution")

GSEA Plot

Método tradicional para visualizar resultados de GSEA.

Parámetros:

GeneSetID Entero. Corresponde al pathway en el objeto 'gse'. El primero pathway es el 1, el segundo el 2, etc.

# Usamos el objeto 'geneset' para que siempre coincidan el título y el gene set correspondiente.
geneset = 1
gseaplot(gse, by = "all", title = gse$Description[geneset], geneSetID = geneset)

KEGG Gene Set Enrichment Analysis con `clusterProfiler`

Para hacer GSEA con KEGG usaremos la función gseKEGG() y tambien cambiaremmos de tipos de ids con bitr como en ORA (arriba).

Como input inicial usaremos original_gene_list que creamos para GSEA de GO.

Prepare Input

# Convertir genes IDs para la función gseKEGG
# Podría ser que se perdieran algunos genes por la conversión
ids<-bitr(names(original_gene_list), fromType = "ENSEMBL", toType = "ENTREZID", OrgDb="org.Hs.eg.db")

# se elimnan ids duplicados (aquí usamos "ENSEMBL", pero debemos usar lo que hayamos empleado en el argumento "fromType")
dedup_ids = ids[!duplicated(ids[c("ENSEMBL")]),]

# Creamos un nuevo dataframe degs2 en cual solo contiene los genes que hicieron match usando ña función bitr
degs2 = degs[degs$ESGN %in% dedup_ids$ENSEMBL,]

# Creamos una nueva coñumna en degs2 con los correspondientes ENTREZ IDs
degs2$Y = dedup_ids$ENTREZID

# Creamos un vector con el universo de genes
kegg_gene_list <- degs2$logFC

# Nombramos el vector con los ENTREZ ids
names(kegg_gene_list) <- degs2$Y

# eliminamos NAs 
kegg_gene_list<-na.omit(kegg_gene_list)

# Ordenamos los datos en orden decreciente (requerido por clusterProfiler)
kegg_gene_list = sort(kegg_gene_list, decreasing = TRUE)

Creación del objeto gseKEGG

Parámetros:

organism Cómo en el ORA (arriba) código del organismo de KEGG. En este caso también "hsa" de humano. Lista completa: https://www.genome.jp/kegg/catalog/org_list.html (need the 3 letter code).
ont Ontología. Alguno de "BP" (procesos biológicos), "MF" (función molecular), "CC" (componente celular) o "ALL" (todas)
minGSSize tamaño mínimo de geneSet para analizar.
maxGSSize tamaño máximo de genes anotados para probar. pvalueCutoff punto de corte del p-value.
pAdjustMethod metodo para ajustar la p, puede ser uno de estos: "holm", "hochberg", "hommel", "bonferroni", "BH", "BY", "fdr", "none"

kk2 <- gseKEGG(geneList     = kegg_gene_list,
               organism     = "hsa",
               minGSSize    = 3,
               maxGSSize    = 800,
               pvalueCutoff = 0.05,
               pAdjustMethod = "none",
               keyType       = "ncbi-geneid")

head(kk2, 10)

Dotplot

dotplot(kk2, showCategory = 10, title = "Enriched Pathways" , split=".sign") + facet_grid(.~.sign)

Ridgeplot

Como en GSEA GO, útil para interpretar vías reguladas al alza o a la baja.

ridgeplot(kk2) + labs(x = "enrichment distribution")

GSEA Plot

Método tradicional para visualizar resultados de GSEA.

Parámetros:

GeneSetID Entero. Corresponde al pathway en el objeto 'gse'. El primero pathway es el 1, el segundo el 2, etc.

# Usamos el objeto 'geneset' para que siempre coincidan el título y el gene set correspondiente.
geneset = 1
gseaplot(kk2, by = "all", title = gse$Description[geneset], geneSetID = geneset)

Pathview

Obviamente podemos usar Pathview para mapear los pathways que salieron significativamente representados en nuestro GSEA.

Parámetros:

gene.data Esta es la lista gene_list creada arriba, el tipo de ids tiene que coincidir con el de gene.idtype pathway.id Tenemos que elegir aquí nosotros alguna. Como la idea es visualizar nuestras vías significativamente enriquecidas, pordemos usar los ids de los pathways que nos sale en head(kk2, 10).
species El id de organism de la función enrichKEGG, en este caso "hsa" gene.idtype el tipo de ids utilizados en gene.data pero sacado del objeto gene.idtype.list. En este caso tomamos el tercer elemento de esta lista.

#BiocManager::install("pathview")
library(pathview)

# Produce una gráfica de KEGG (PNG) Usaremos hsa05322 proque el primer pathway más enriquecido fue el mismo que graficamos arriba
hsa <- pathview(gene.data=gene_list, pathway.id="hsa05322", species = "hsa", gene.idtype=gene.idtype.list[3])

# Produce una gráfica diferente (PDF)
hsa <- pathview(gene.data=gene_list, pathway.id="hsa05322", species = "hsa", gene.idtype=gene.idtype.list[3], kegg.native = FALSE)

Las imágenes se salvan en su directorio de trabajo.

Más recursos:

Sobre clusterProfiler

Sitio web: https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/clusterProfiler/inst/doc/clusterProfiler.html

Tutorial: https://alexslemonade.github.io/refinebio-examples/03-rnaseq/pathway-analysis_rnaseq_01_ora.html

Sobre enriquecimiento

artículo "Pathway size matters: the influence of pathway granularity on over-representation (enrichment analysis) statistics" https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-021-07502-8

Tutorial "Functional Analysis for RNA-seq" https://hbctraining.github.io/DGE_workshop_salmon_online/lessons/10_FA_over-representation_analysis.html

Footnotes

Para más detalles ver: Gómez-Romero, et al. (2021) "Bioinformatics of Functional Categories Enrichment" in Bioinformatics and Human Genomics Research eBook ISBN: 9781003005926. ↩

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Entonces ¿Para qué queremos clusterProfiler?

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Instalar y cargar paquetes

Anotación

Preparar entrada

Crear objeto enrichGO

Creación del objeto enrichResult

Output

Table of results

Upset Plot

Barplot

Dotplot

KEGG Over-representation analysis

Prepare Data

Creamos el objeto enrichKEGG

Barplot

Dotplot

Pathview

Gene Set Enrichment Analysis

GO Gene Set Enrichment Analysis con clusterProfiler

Instalación y cargado de paquetes

Anotación

Prepare Input

Gene Set Enrichment

Outputs

Tabla de resultados

Dotplot

Ridgeplot

GSEA Plot

KEGG Gene Set Enrichment Analysis con clusterProfiler

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Creación del objeto gseKEGG

Dotplot

Ridgeplot

GSEA Plot

Pathview

Más recursos:

Sobre clusterProfiler

Sobre enriquecimiento

Footnotes

Introducción a `clusterProfiler`

GO Over-representation analysis con `clusterProfiler`

Creación del objeto `enrichResult`

Creamos el objeto `enrichKEGG`

GO Gene Set Enrichment Analysis con `clusterProfiler`

KEGG Gene Set Enrichment Analysis con `clusterProfiler`