在RNA-Seq的分析中，为了获得差异表达基因，只需要对不同基因的测序Read数进行比较即可。然而比对到不同基因上的Read数目并不能直接用于比较这两个基因的表达量差异，因为在RNA-seq中有一个很浅显的道理，基因越长，比对到此基因上的Read就会越多；测序深度越大，那么本次RNA-seq的所有Read数都会增加。也就是说Read数除了和基因表达量相关外，也和基因的长度、测序深度有关，因此为了比较多个RNA-seq重复（测序深度有一定差异）的不同基因（基因长度有一定差异）之间的表达量差异，那么就不能使用Read数直接进行比较，而是需要对Read数进行标准化。
- 不同基因在同一个样本中，基因越长，随即打断之后得到的片段就越多，该基因被测到的概率就越大，落在该基因上的 reads 就越多。所以，要排除基因长度的影响。
- 同一个基因在不同样本中，样本的测序深度越高，相当于抽样次数越多，落在该样本中基因上的 reads 就越多。所以，要排除测序深度的影响。
要去除测序深度和基因长度的的影响，最简单的办法就是给 read counts 除以总 Reads 数和基因长度的。
1.给 read counts 除以基因长度，这里以 kb 为单位, 得到以下表格
2.将每个样品的 read counts 合并，添加一行 Total Reads
3.再除以 Total Reads，以million(M)为单位，得到以下表格
通过标准化之后的结果可以发现：
- 在样本1 中，基因A和基因B的表达量是一样高的；
- 基因A，在样本3中的表达只是略高于样本2。
RPKM的 全称是 Reads per kilobase of exon per million reads mapped，这个 Per Kilobase 是基因长度的单位、Per Millon 是测序深度的单位。
FPKM的全称是 Fragments per kilobase of exon per million reads mapped。建库测序是一个随机抽样的过程，而这个抽样的样品事实上是以 Fragments 为单位，而不是 Reads。
当 single-end 测序的时候，RPKM 与 FPKM 是等价的；当 pair-end 测序的时候，应该使用 FPKM。所以，FPKM 是更为通用的单位。
TPM 的全称是 Transcripts per million reads。它与 FPKM 唯一的区别是，第二步除的不是 Total Reads
1.给 read counts 除以基因长度，这里以 kb 为单位, 得到以下表格
2.将每个样品的数值求和，添加一行 Total
3.再除以 Total，得到以下表格
FPKM 的公式中，
所以，TPM 
如果我们能够明确知道一个细胞中、或者是一定摩尔量的 RNA中，有多少条某种转录本。这叫绝对定量。
但是，我们在进行转录组测序的时候，并不知道用于建库测序的 RNA 来自多少个细胞，总过有多少转录本。所以只能进行相对定量。相对定量，描述的是该基因的转录本占样本中所有转录本的百分比。
如果能够对样品进行细胞计数或者添加 spike-in, 转录组也可以实现绝对定量，不过这不在本文的讨论范围。
FPKM／RPKM／TPM都是描述相对定量的单位。
TPM中各个样本的总和是相等的，而FPKM则不相等。所以更推荐用TPM。TPM值就是RPKM的百分比！！！